Yapay Zekâ Destekli Gerçek Zamanlı Kolorimetrik/Floresans LAMP Cihazı ve Cryphonectria parasitica Tanı Kiti Geliştirilmesi ile Kestane Kanserinin Hızlı Teşhisi
Proje Durumu: Devam Ediyor
Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Yasemin ÇELİK ALTUNOĞLU
Proje Kodu: KÜ-İHT/2024-05
Proje Başlama Tarihi: 04.03.2025
Proje Süresi: 24 Ay
Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Yasemin ÇELİK ALTUNOĞLU
Proje Kodu: KÜ-İHT/2024-05
Proje Başlama Tarihi: 04.03.2025
Proje Süresi: 24 Ay
ÖZET
Bu proje, kestane ağaçlarını tehdit eden ve kestane meyvesi ile kestane balı üretiminde ciddi kayıplara neden olan Cryphonectria parasitica’nın hızlı ve doğru bir şekilde teşhis edilmesini sağlamak amacıyla, yapay zekâ destekli bir LAMP (İzotermal Döngü Aracılı Amplifikasyon) cihazı ve ilgili izotermal amplifikasyon tanı kitinin geliştirilmesini hedeflemektedir. LAMP, izotermal koşullarda nükleik asit amplifikasyonu sağlayarak, hedef patojenlerin DNA veya RNA’sını yüksek hassasiyet ve özgüllük ile tespit edebilen bir moleküler tanı yöntemidir. Proje kapsamında, öncelikle kestane ağaçlarında yaygın olarak görülen Cryphonectria parasitica’ya özgü hedef gen bölgeleri belirlenecek ve bu bölgeleri spesifik olarak amplifiye edecek LAMP primerleri tasarlanıp optimize edilecektir.
Bu bağlamda hem kolorimetrik hem de floresan tespit yöntemlerini bir arada kullanabilen yenilikçi bir LAMP cihazı geliştirilecektir. Cihaz, entegre görüntü işleme ve derin öğrenme algoritmaları sayesinde, patojen teşhisini otomatikleştirerek sonuçları hızlı bir şekilde kullanıcıya sunacaktır. Geliştirilen prototip cihaz ve tanı kitlerinin performansı, geleneksel teşhis yöntemleri ve ticari LAMP cihazıyla karşılaştırılarak değerlendirilecek; cihazın doğruluğu, hassasiyeti, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği doğrulanacaktır.
Proje, aynı zamanda CE ve IVDR kriterlerine uygun bir cihaz tasarımı hedefleyerek, ürünün Avrupa Birliği pazarına erişimini ve kullanıcı güvenliğini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu projenin başarılı bir şekilde tamamlanması, kestane yetiştiriciliğinde verim kayıplarının azaltılması, orman sağlığının korunması ve sürdürülebilir orman yönetiminin desteklenmesi gibi önemli faydalar sağlayacaktır. Ayrıca, proje, Kastamonu Üniversitesi ve bölgenin teknoloji ve inovasyon kapasitesini artırarak, biyoteknoloji sektöründe nitelikli iş gücü yetiştirilmesine ve yeni iş imkânları yaratılmasına katkıda bulunacaktır.
Geliştirilen prototip, izotermal amplifikasyon teknolojisinin avantajlarını yapay zeka ve görüntü işleme teknikleriyle birleştirerek, mevcut teknolojilere kıyasla daha hızlı ve güvenilir bir teşhis aracı sunacaktır. Projenin sonunda, geliştirilen cihaz ve kitin performansı, gerçek dünya koşullarında, Kastamonu’dan toplanan kestane örnekleri üzerinde test edilecek ve ticari cihazlarla kıyaslanacaktır. Elde edilen veriler, geliştirilen teknolojinin bölgesel ve ulusal düzeyde tarımsal ve ormansal üretime yapacağı katkıyı belirlemek için kritik öneme sahiptir.
Sonuç olarak, bu proje, Kastamonu’da ve Türkiye genelinde kestane üretiminin devamlılığını sağlamak, tarımsal verimliliği artırmak ve orman ekosistemlerini korumak adına bölgesel kalkınmaya önemli bir katkı sunmayı hedeflemektedir. Ayrıca, proje çıktılarının ticarileştirilmesi ve patent başvuruları ile Türkiye’nin bilimsel ve teknolojik araştırma gücünün artırılması ve uluslararası alanda öncü bir konuma gelmesi hedeflenmektedir.
Anahtar Kelimeler: Ormancılık, Görüntü İşleme, Yapay Zekâ, Erken Teşhis, LAMP, Kestane, Kanseri, Cryphonectria parasitica
ABSTRACT
This project aims to develop an AI-supported LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) device and a corresponding isothermal amplification diagnostic kit for the rapid and accurate detection of Cryphonectria parasitica, a pathogen that threatens chestnut trees and causes significant losses in the production of chestnut fruit and chestnut honey. LAMP is a molecular diagnostic method that can detect DNA or RNA of target pathogens with high sensitivity and specificity by providing nucleic acid amplification under isothermal conditions. Within the scope of the project, target gene regions specific to Cryphonectria parasitica, which is common in chestnut trees, will be identified and LAMP primers that will specifically amplify these regions will be designed and optimised.
In this context, an innovative LAMP device that can use both colorimetric and fluorescence detection methods together will be developed. Thanks to integrated image processing and deep learning algorithms, the device will automate pathogen diagnosis and present the results to the user quickly. The performance of the developed prototype device and diagnostic kits will be evaluated by comparing with conventional diagnostic methods and commercial LAMP device; the accuracy, sensitivity, specificity and reproducibility of the device will be verified.
The project also aims to ensure product access to the European Union market and user safety by targeting a device design that complies with CE and IVDR criteria. The successful completion of this project will provide significant benefits such as reducing yield losses in chestnut cultivation, protecting forest health and supporting sustainable forest management. In addition, the project will contribute to the training of qualified labour force and creation of new job opportunities in the biotechnology sector by increasing the technology and innovation capacity of Kastamonu University and the region.
The developed prototype will combine the advantages of isothermal amplification technology with artificial intelligence and image processing techniques to provide a faster and more reliable diagnostic tool compared to existing technologies. At the end of the project, the performance of the developed device and kit will be tested under real world conditions on chestnut samples collected from Kastamonu and compared with commercial devices. The data obtained is critical to determine the contribution of the developed technology to agricultural and forestry production at regional and national level.
As a result, this project aims to make a significant contribution to regional development in Kastamonu and Turkey in order to ensure the continuity of chestnut production, increase agricultural productivity and protect forest ecosystems. In addition, it is aimed to increase Turkey’s scientific and technological research power and to become a pioneer in the international arena with the commercialisation of project outputs and patent applications.
Keywords: Forestry, Image Processing, Artificial Intelligence, Early Diagnosis, LAMP, Chestnut, Chestnut Cancer, Cryphonectria parasitica
Bu proje, kestane ağaçlarını tehdit eden ve kestane meyvesi ile kestane balı üretiminde ciddi kayıplara neden olan Cryphonectria parasitica’nın hızlı ve doğru bir şekilde teşhis edilmesini sağlamak amacıyla, yapay zekâ destekli bir LAMP (İzotermal Döngü Aracılı Amplifikasyon) cihazı ve ilgili izotermal amplifikasyon tanı kitinin geliştirilmesini hedeflemektedir. LAMP, izotermal koşullarda nükleik asit amplifikasyonu sağlayarak, hedef patojenlerin DNA veya RNA’sını yüksek hassasiyet ve özgüllük ile tespit edebilen bir moleküler tanı yöntemidir. Proje kapsamında, öncelikle kestane ağaçlarında yaygın olarak görülen Cryphonectria parasitica’ya özgü hedef gen bölgeleri belirlenecek ve bu bölgeleri spesifik olarak amplifiye edecek LAMP primerleri tasarlanıp optimize edilecektir.
Bu bağlamda hem kolorimetrik hem de floresan tespit yöntemlerini bir arada kullanabilen yenilikçi bir LAMP cihazı geliştirilecektir. Cihaz, entegre görüntü işleme ve derin öğrenme algoritmaları sayesinde, patojen teşhisini otomatikleştirerek sonuçları hızlı bir şekilde kullanıcıya sunacaktır. Geliştirilen prototip cihaz ve tanı kitlerinin performansı, geleneksel teşhis yöntemleri ve ticari LAMP cihazıyla karşılaştırılarak değerlendirilecek; cihazın doğruluğu, hassasiyeti, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği doğrulanacaktır.
Proje, aynı zamanda CE ve IVDR kriterlerine uygun bir cihaz tasarımı hedefleyerek, ürünün Avrupa Birliği pazarına erişimini ve kullanıcı güvenliğini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu projenin başarılı bir şekilde tamamlanması, kestane yetiştiriciliğinde verim kayıplarının azaltılması, orman sağlığının korunması ve sürdürülebilir orman yönetiminin desteklenmesi gibi önemli faydalar sağlayacaktır. Ayrıca, proje, Kastamonu Üniversitesi ve bölgenin teknoloji ve inovasyon kapasitesini artırarak, biyoteknoloji sektöründe nitelikli iş gücü yetiştirilmesine ve yeni iş imkânları yaratılmasına katkıda bulunacaktır.
Geliştirilen prototip, izotermal amplifikasyon teknolojisinin avantajlarını yapay zeka ve görüntü işleme teknikleriyle birleştirerek, mevcut teknolojilere kıyasla daha hızlı ve güvenilir bir teşhis aracı sunacaktır. Projenin sonunda, geliştirilen cihaz ve kitin performansı, gerçek dünya koşullarında, Kastamonu’dan toplanan kestane örnekleri üzerinde test edilecek ve ticari cihazlarla kıyaslanacaktır. Elde edilen veriler, geliştirilen teknolojinin bölgesel ve ulusal düzeyde tarımsal ve ormansal üretime yapacağı katkıyı belirlemek için kritik öneme sahiptir.
Sonuç olarak, bu proje, Kastamonu’da ve Türkiye genelinde kestane üretiminin devamlılığını sağlamak, tarımsal verimliliği artırmak ve orman ekosistemlerini korumak adına bölgesel kalkınmaya önemli bir katkı sunmayı hedeflemektedir. Ayrıca, proje çıktılarının ticarileştirilmesi ve patent başvuruları ile Türkiye’nin bilimsel ve teknolojik araştırma gücünün artırılması ve uluslararası alanda öncü bir konuma gelmesi hedeflenmektedir.
Anahtar Kelimeler: Ormancılık, Görüntü İşleme, Yapay Zekâ, Erken Teşhis, LAMP, Kestane, Kanseri, Cryphonectria parasitica
ABSTRACT
This project aims to develop an AI-supported LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) device and a corresponding isothermal amplification diagnostic kit for the rapid and accurate detection of Cryphonectria parasitica, a pathogen that threatens chestnut trees and causes significant losses in the production of chestnut fruit and chestnut honey. LAMP is a molecular diagnostic method that can detect DNA or RNA of target pathogens with high sensitivity and specificity by providing nucleic acid amplification under isothermal conditions. Within the scope of the project, target gene regions specific to Cryphonectria parasitica, which is common in chestnut trees, will be identified and LAMP primers that will specifically amplify these regions will be designed and optimised.
In this context, an innovative LAMP device that can use both colorimetric and fluorescence detection methods together will be developed. Thanks to integrated image processing and deep learning algorithms, the device will automate pathogen diagnosis and present the results to the user quickly. The performance of the developed prototype device and diagnostic kits will be evaluated by comparing with conventional diagnostic methods and commercial LAMP device; the accuracy, sensitivity, specificity and reproducibility of the device will be verified.
The project also aims to ensure product access to the European Union market and user safety by targeting a device design that complies with CE and IVDR criteria. The successful completion of this project will provide significant benefits such as reducing yield losses in chestnut cultivation, protecting forest health and supporting sustainable forest management. In addition, the project will contribute to the training of qualified labour force and creation of new job opportunities in the biotechnology sector by increasing the technology and innovation capacity of Kastamonu University and the region.
The developed prototype will combine the advantages of isothermal amplification technology with artificial intelligence and image processing techniques to provide a faster and more reliable diagnostic tool compared to existing technologies. At the end of the project, the performance of the developed device and kit will be tested under real world conditions on chestnut samples collected from Kastamonu and compared with commercial devices. The data obtained is critical to determine the contribution of the developed technology to agricultural and forestry production at regional and national level.
As a result, this project aims to make a significant contribution to regional development in Kastamonu and Turkey in order to ensure the continuity of chestnut production, increase agricultural productivity and protect forest ecosystems. In addition, it is aimed to increase Turkey’s scientific and technological research power and to become a pioneer in the international arena with the commercialisation of project outputs and patent applications.
Keywords: Forestry, Image Processing, Artificial Intelligence, Early Diagnosis, LAMP, Chestnut, Chestnut Cancer, Cryphonectria parasitica
BEKLENEN PROJE ÇIKTILARI
Kısa vadede, laboratuvar ortamında çalışan, LAMP optik-ısıtma modülü ile yapay zekâ destekli analiz yazılımını tek bir masaüstü uygulamasında birleştiren entegre prototip teslim edilir. Donanım tarafında ısıtıcı blok, sıcaklık sensörleri, kamera ve çoklu LED sürücüleri COM üzerinden yönetilir. Yazılım tarafında Login, Mode, LAMP ve AI arayüzleri kararlı çalışır. Görüntü işleme hattı gürültü azaltma, kontrast iyileştirme, tüp konturuna dayalı ROI tespiti, arka plan çıkarımı ve referans/başlangıç normalizasyonu ile optimize edilir. Her ROI için şiddet-zaman grafikleri üretilir. CNN’in ilk sürümü eğitilir. Başlangıç performansı için doğruluk, hassasiyet, duyarlılık ve ROC-AUC raporlanır. Zamana bağlı ham görüntüler, ROI maskeleri, etiketler ve ölçüm tablolarından oluşan veri paketi ile otomatik PDF rapor üreticisi tamamlanır. Sıcaklık- zaman ve şiddet-zaman grafikleri hem görsel hem CSV olarak sağlanır. Durum günlüğü ve uyarı mekanizmaları tanımlanır. Ayrıca, kestane kanserinin (Cryphonectria parasitica) teşhisine yönelik LAMP kit’inin ilk taslağı da ortaya konur. Hedef genlere özgü primer paneli tasarlanır ve optimize edilir, pozitif/negatif kontrol tüpleri ile patojen DNA’sı içeren internal kontrol prosedürü tanımlanır, örnek hazırlama SOP (Standard Operating Procedure)’ları ve ön LoD denemeleri hazırlanır. Kullanıcı dostu LCD ekran arayüzü ve temel optik hizalama testleri de tamamlanır. LAMP Kit Bileşimi (kısa vade): Master mix (Bst polimeraz/RT, dNTP, Mg2+, UDG/UNG taşıma kontaminasyonu önleme sistemi), renk göstergesi için fenol kırmızısı veya hidroksinaftol mavisi (HNB) opsiyonu, floresan izleme için SYTO/EvaGreen alternatifi, hedefe özgü F3/B3, FIP/BIP ve LF/LB primer setleri; pozitif kontrol (sentetik gen blok), negatif kontrol (NTC), internal kontrol (IC) karışımı ve proses kontrolü (ekstraksiyon verimini gözeten, farklı hedefli DNA) tüpleri. Ön performans hedefleri şu şekildedir; analitik LoD ≤10² kopya/reak., time-to-positive ≤30–40 dk, IC başarısızlık oranı <%2, lotlar arası Ct/Tt varyansı <%5.
Takip eden orta vadede, laboratuvarda doğrulanmış prototipi sahaya yakın koşullara taşımak ve performansı karşılaştırmalı testlerle güvenceye almaktır. Bu kapsamda, referans LAMP kitleri ve muadil cihazlarla yan yana çalıştırılarak duyarlılık ve tekrarlanabilirlik analizleri yapılır. CNN modeli için daha geniş ve dengeli veri kümesi oluşturulur. Kullanıcı geri bildirimleri doğrultusunda ergonomi (numune yerleşimi, yan görünüm hizalaması), taşınabilirlik (güç tüketimi, mekanik dayanım) ve kullanılabilirlik (hata mesajları, durum günlüğü, tek tıkla kayıt) iyileştirilir. Kestane kanserine özgü LAMP kiti için reaktif formülasyonu, kapsayıcılık/dışlayıcılık panelleri, LoD doğrulaması, raf ömrü ve stabilite testleri ile kullanım talimatı tamamlanır. Düzenleyici yol haritasına uygun şekilde tasarım doğrulama dosyaları, risk analizi, izlenebilirlik matrisi, bakım/servis planları, EMC ve siber güvenlik politikaları ile saha kullanım protokolleri olgunlaştırılır.
Lamp kitine ait kapsayıcılık/dışlayıcılık paneli (orta vade) ile değerlendirme şunlar kullanılarak gerçekleştirilecektir; C. parasitica’nın farklı soy/izolatları (en az 20 temsil) ile kapsayıcılık; yakın akraba/ortak niş paylaşan türler (Cryphonectria spp., Endothia spp., Botryosphaeriaceae üyeleri, Trichoderma, Saccharomyces, bitki DNA, çevresel mikrobiota). Çapraz reaktivite ≤%1 olması hedeflenmektedir. 25/37/45 °C’de hızlandırılmış stabilite testleri ve 24 aya kadar gerçek zamanlı stabilite testleri ile belirlenecektir. Kritik kabul kriterler; renk/floresan arka planı, Tt kayması ≤%10, IC başarı oranı ≥%98 şeklinde kabul edilecektir. Kabuk, kambiyum kazıntısı, konidya süspansiyonu ve saha sürüntüsü için validasyon gerçekleştirilecektir ve matris/numune türleri belirlenecektir. Ekstraksiyonsuz protokol opsiyonu (ısı-lizis buffer) ile kıyaslama ekstraksiyonlu yöntem karşılaştırılacaktır.
Uzun vadede ise sistemi TRL-7 olgunluk seviyesine yükseltmek, CE/IVDR gereklilikleriyle uyumlu bir ürün ailesi hâline getirmek ve yaygın saha kullanımına geçmektir. Bu aşamada cihaz içi tekrarlanabilirlik <%2 ve cihazlar arası <%5 hedefleriyle kalite güvence planı uygulanır. Çevresel stres, titreşim ve uzun süreli stabilite testleri tamamlanır. LAMP kiti üretime hazır paketlenir. Lot izlenebilirliği ve raf ömrü/stabilite tanımlanır. qPCR karşılaştırmaları raporlanır. Sahadan toplanan gerçek kullanım verileriyle sistem ve kit tekrardan güncellenir. Ticarileşme için fikrî mülkiyet başvuruları gerçekleştirilir. Kurumsal iş birlikleriyle orman teşkilatı ve ilgili Ar-Ge birimlerinde pilot kurulumlar gerçekleştirilir; teknoloji transferi ve eğitim programları başlatılır. Ek olarak, 2 patent başvurusu ve 2 marka tescili hedeflenir. Uzun vadede IVDR Uyum Yol Haritası şu şekilde planlanmıştır: Ürün sınıflandırması, performans değerlendirme planı (analitik/klinik), klinik performans çalışmaları (sahadan toplanan örneklerde qPCR karşılaştırmalı), PMS/PMPF planları, UDI ve EUDAMED kayıtları, biyolojik risk yönetimi ve atık bertaraf prosedürleri.
BEKLENEN PROJE ÇIKTILARININ UYGULAMA PLANI
Kısa vadede, cihaz, yazılım ve LAMP kit çalışmaları eşzamanlı ilerleyecek şekilde kurgulanmıştır. Cihaz tarafında ısıtıcı blok, sensörler, kamera ve çoklu LED sürücülerinin entegrasyonu tamamlanacak; PID ayarı, termal homojenlik testi, LED şiddeti, optik hizalama kalibrasyonu ve COM haberleşme güvenilirliği doğrulanacaktır. Yazılım tarafında Login, Mode, LAMP, AI arayüzleri çalışır hâle getirilecektir. Ön işleme, ROI tespiti ve arka plan çıkarımı optimize edilecek. Şiddet-zaman ve sıcaklık-zaman grafikleri gerçek zamanlı olarak güncellenecek; otomatik PDF/CSV raporlayıcı, durum günlüğü ve uyarı mekanizmaları devreye alınacaktır. CNN modeli veri setiyle eğitilecek, eşik kalibrasyonu sağlanacaktır. LAMP kiti kestane kanserine özgü primerler, pozitif/negatif ve internal kontrol tüpleri ile örnek hazırlama SOP’ları oluşturulacaktır. LoD ön kestirimi, stabilite ve raf ömrü ön denemeleri yapılacaktır. Ek olarak, internal kontrol validasyonu ve kullanıcı eğitim modülleri tasarlanacaktır. LAMP kitinin optimizasyonu açısından ise; primer-probe panel taraması (≥3 hedef bölge), UDG/UNG optimizasyonu, pH-indikatör ve floresan boyanın cihaz optiğiyle uyum kalibrasyonu, ekstraksiyonsuz tampon seti denemeleri, saha “sample-to-answer” akışının (≤3 adım) prototiplenmesi adımları gerçekleştirilecektir.
Orta vadede prototipi saha koşullarına yaklaştırarak doğrulamayı, kestane kanserine özgü LAMP kit’ini olgunlaştırma hedeflenmektedir. Bu dönemde ticari LAMP ve qPCR sistemleriyle yan yana çalışmalar yürütülür. Donanım ergonomisi, taşınabilirlik ve güç bütçesi iyileştirilir; optik hizalama ve termal homojenlik için testler yapılır. LAMP kit için LoD doğrulaması ile kapsayıcılık/dışlayıcılık panelleri tamamlanır, IFU, lot izlenebilirliği ve taşıma-stabilite koşulları kesinleştirilir. Risk analizi, izlenebilirlik matrisi, tasarım doğrulama/EMC planları ve siber güvenlik politikası hazırlanır. DFM/DFA süreçleri ile üretime hazırlık planları yapılır ve tedarikçi kalifikasyonu tamamlanır. İmalat ölçekli liofilizasyon çevrim parametrelerinin (primary/secondary drying) belirlenmesi, dolum-kapama validasyonu, hızlandırılmış ve gerçek zamanlı stabilite ara analizleri, lot serbest bırakma kriterlerinin dondurulması, körörnek ve spike-in kontrollü saha denemeleri.
Uzun vadede ise, sistemi TRL-7 olgunluğa çıkarıp CE/IVDR uyumlu bir ürüne dönüştürmektir. LAMP kitini de seri üretime uygun biçimde validasyon, lot izlenebilirliği, raf ömrü ve kapsayıcılık/dışlayıcılık bilgileri oluşturulur. Kurumlarla pilotlardan bölgesel yayılıma geçilir. Eğitim programları, saha destek ağı ve lisanslama modeli devreye alınır. Projenin başarı ölçütleri sertifikasyon kabulü, saha bakım ve servis süreçleri, birim maliyet ve kullanıcı memnuniyetidir. Ayrıca, ürünün uluslararası ticarileşmesi için ihracat stratejileri ve regülasyon uyumluluk dosyaları hazırlanır. Performans çalışmaları için örneklem büyüklüğü ve istatistik planı, referans materyal standardizasyonu (kopya/reak. kalibrasyonu), UDI etiketleme ve EUDAMED kayıt; PMS-trend analizleri ve PMPF (saha veri toplama) çevrimi gibi adımlar planlanmıştır.
Kısa vadede, laboratuvar ortamında çalışan, LAMP optik-ısıtma modülü ile yapay zekâ destekli analiz yazılımını tek bir masaüstü uygulamasında birleştiren entegre prototip teslim edilir. Donanım tarafında ısıtıcı blok, sıcaklık sensörleri, kamera ve çoklu LED sürücüleri COM üzerinden yönetilir. Yazılım tarafında Login, Mode, LAMP ve AI arayüzleri kararlı çalışır. Görüntü işleme hattı gürültü azaltma, kontrast iyileştirme, tüp konturuna dayalı ROI tespiti, arka plan çıkarımı ve referans/başlangıç normalizasyonu ile optimize edilir. Her ROI için şiddet-zaman grafikleri üretilir. CNN’in ilk sürümü eğitilir. Başlangıç performansı için doğruluk, hassasiyet, duyarlılık ve ROC-AUC raporlanır. Zamana bağlı ham görüntüler, ROI maskeleri, etiketler ve ölçüm tablolarından oluşan veri paketi ile otomatik PDF rapor üreticisi tamamlanır. Sıcaklık- zaman ve şiddet-zaman grafikleri hem görsel hem CSV olarak sağlanır. Durum günlüğü ve uyarı mekanizmaları tanımlanır. Ayrıca, kestane kanserinin (Cryphonectria parasitica) teşhisine yönelik LAMP kit’inin ilk taslağı da ortaya konur. Hedef genlere özgü primer paneli tasarlanır ve optimize edilir, pozitif/negatif kontrol tüpleri ile patojen DNA’sı içeren internal kontrol prosedürü tanımlanır, örnek hazırlama SOP (Standard Operating Procedure)’ları ve ön LoD denemeleri hazırlanır. Kullanıcı dostu LCD ekran arayüzü ve temel optik hizalama testleri de tamamlanır. LAMP Kit Bileşimi (kısa vade): Master mix (Bst polimeraz/RT, dNTP, Mg2+, UDG/UNG taşıma kontaminasyonu önleme sistemi), renk göstergesi için fenol kırmızısı veya hidroksinaftol mavisi (HNB) opsiyonu, floresan izleme için SYTO/EvaGreen alternatifi, hedefe özgü F3/B3, FIP/BIP ve LF/LB primer setleri; pozitif kontrol (sentetik gen blok), negatif kontrol (NTC), internal kontrol (IC) karışımı ve proses kontrolü (ekstraksiyon verimini gözeten, farklı hedefli DNA) tüpleri. Ön performans hedefleri şu şekildedir; analitik LoD ≤10² kopya/reak., time-to-positive ≤30–40 dk, IC başarısızlık oranı <%2, lotlar arası Ct/Tt varyansı <%5.
Takip eden orta vadede, laboratuvarda doğrulanmış prototipi sahaya yakın koşullara taşımak ve performansı karşılaştırmalı testlerle güvenceye almaktır. Bu kapsamda, referans LAMP kitleri ve muadil cihazlarla yan yana çalıştırılarak duyarlılık ve tekrarlanabilirlik analizleri yapılır. CNN modeli için daha geniş ve dengeli veri kümesi oluşturulur. Kullanıcı geri bildirimleri doğrultusunda ergonomi (numune yerleşimi, yan görünüm hizalaması), taşınabilirlik (güç tüketimi, mekanik dayanım) ve kullanılabilirlik (hata mesajları, durum günlüğü, tek tıkla kayıt) iyileştirilir. Kestane kanserine özgü LAMP kiti için reaktif formülasyonu, kapsayıcılık/dışlayıcılık panelleri, LoD doğrulaması, raf ömrü ve stabilite testleri ile kullanım talimatı tamamlanır. Düzenleyici yol haritasına uygun şekilde tasarım doğrulama dosyaları, risk analizi, izlenebilirlik matrisi, bakım/servis planları, EMC ve siber güvenlik politikaları ile saha kullanım protokolleri olgunlaştırılır.
Lamp kitine ait kapsayıcılık/dışlayıcılık paneli (orta vade) ile değerlendirme şunlar kullanılarak gerçekleştirilecektir; C. parasitica’nın farklı soy/izolatları (en az 20 temsil) ile kapsayıcılık; yakın akraba/ortak niş paylaşan türler (Cryphonectria spp., Endothia spp., Botryosphaeriaceae üyeleri, Trichoderma, Saccharomyces, bitki DNA, çevresel mikrobiota). Çapraz reaktivite ≤%1 olması hedeflenmektedir. 25/37/45 °C’de hızlandırılmış stabilite testleri ve 24 aya kadar gerçek zamanlı stabilite testleri ile belirlenecektir. Kritik kabul kriterler; renk/floresan arka planı, Tt kayması ≤%10, IC başarı oranı ≥%98 şeklinde kabul edilecektir. Kabuk, kambiyum kazıntısı, konidya süspansiyonu ve saha sürüntüsü için validasyon gerçekleştirilecektir ve matris/numune türleri belirlenecektir. Ekstraksiyonsuz protokol opsiyonu (ısı-lizis buffer) ile kıyaslama ekstraksiyonlu yöntem karşılaştırılacaktır.
Uzun vadede ise sistemi TRL-7 olgunluk seviyesine yükseltmek, CE/IVDR gereklilikleriyle uyumlu bir ürün ailesi hâline getirmek ve yaygın saha kullanımına geçmektir. Bu aşamada cihaz içi tekrarlanabilirlik <%2 ve cihazlar arası <%5 hedefleriyle kalite güvence planı uygulanır. Çevresel stres, titreşim ve uzun süreli stabilite testleri tamamlanır. LAMP kiti üretime hazır paketlenir. Lot izlenebilirliği ve raf ömrü/stabilite tanımlanır. qPCR karşılaştırmaları raporlanır. Sahadan toplanan gerçek kullanım verileriyle sistem ve kit tekrardan güncellenir. Ticarileşme için fikrî mülkiyet başvuruları gerçekleştirilir. Kurumsal iş birlikleriyle orman teşkilatı ve ilgili Ar-Ge birimlerinde pilot kurulumlar gerçekleştirilir; teknoloji transferi ve eğitim programları başlatılır. Ek olarak, 2 patent başvurusu ve 2 marka tescili hedeflenir. Uzun vadede IVDR Uyum Yol Haritası şu şekilde planlanmıştır: Ürün sınıflandırması, performans değerlendirme planı (analitik/klinik), klinik performans çalışmaları (sahadan toplanan örneklerde qPCR karşılaştırmalı), PMS/PMPF planları, UDI ve EUDAMED kayıtları, biyolojik risk yönetimi ve atık bertaraf prosedürleri.
BEKLENEN PROJE ÇIKTILARININ UYGULAMA PLANI
Kısa vadede, cihaz, yazılım ve LAMP kit çalışmaları eşzamanlı ilerleyecek şekilde kurgulanmıştır. Cihaz tarafında ısıtıcı blok, sensörler, kamera ve çoklu LED sürücülerinin entegrasyonu tamamlanacak; PID ayarı, termal homojenlik testi, LED şiddeti, optik hizalama kalibrasyonu ve COM haberleşme güvenilirliği doğrulanacaktır. Yazılım tarafında Login, Mode, LAMP, AI arayüzleri çalışır hâle getirilecektir. Ön işleme, ROI tespiti ve arka plan çıkarımı optimize edilecek. Şiddet-zaman ve sıcaklık-zaman grafikleri gerçek zamanlı olarak güncellenecek; otomatik PDF/CSV raporlayıcı, durum günlüğü ve uyarı mekanizmaları devreye alınacaktır. CNN modeli veri setiyle eğitilecek, eşik kalibrasyonu sağlanacaktır. LAMP kiti kestane kanserine özgü primerler, pozitif/negatif ve internal kontrol tüpleri ile örnek hazırlama SOP’ları oluşturulacaktır. LoD ön kestirimi, stabilite ve raf ömrü ön denemeleri yapılacaktır. Ek olarak, internal kontrol validasyonu ve kullanıcı eğitim modülleri tasarlanacaktır. LAMP kitinin optimizasyonu açısından ise; primer-probe panel taraması (≥3 hedef bölge), UDG/UNG optimizasyonu, pH-indikatör ve floresan boyanın cihaz optiğiyle uyum kalibrasyonu, ekstraksiyonsuz tampon seti denemeleri, saha “sample-to-answer” akışının (≤3 adım) prototiplenmesi adımları gerçekleştirilecektir.
Orta vadede prototipi saha koşullarına yaklaştırarak doğrulamayı, kestane kanserine özgü LAMP kit’ini olgunlaştırma hedeflenmektedir. Bu dönemde ticari LAMP ve qPCR sistemleriyle yan yana çalışmalar yürütülür. Donanım ergonomisi, taşınabilirlik ve güç bütçesi iyileştirilir; optik hizalama ve termal homojenlik için testler yapılır. LAMP kit için LoD doğrulaması ile kapsayıcılık/dışlayıcılık panelleri tamamlanır, IFU, lot izlenebilirliği ve taşıma-stabilite koşulları kesinleştirilir. Risk analizi, izlenebilirlik matrisi, tasarım doğrulama/EMC planları ve siber güvenlik politikası hazırlanır. DFM/DFA süreçleri ile üretime hazırlık planları yapılır ve tedarikçi kalifikasyonu tamamlanır. İmalat ölçekli liofilizasyon çevrim parametrelerinin (primary/secondary drying) belirlenmesi, dolum-kapama validasyonu, hızlandırılmış ve gerçek zamanlı stabilite ara analizleri, lot serbest bırakma kriterlerinin dondurulması, körörnek ve spike-in kontrollü saha denemeleri.
Uzun vadede ise, sistemi TRL-7 olgunluğa çıkarıp CE/IVDR uyumlu bir ürüne dönüştürmektir. LAMP kitini de seri üretime uygun biçimde validasyon, lot izlenebilirliği, raf ömrü ve kapsayıcılık/dışlayıcılık bilgileri oluşturulur. Kurumlarla pilotlardan bölgesel yayılıma geçilir. Eğitim programları, saha destek ağı ve lisanslama modeli devreye alınır. Projenin başarı ölçütleri sertifikasyon kabulü, saha bakım ve servis süreçleri, birim maliyet ve kullanıcı memnuniyetidir. Ayrıca, ürünün uluslararası ticarileşmesi için ihracat stratejileri ve regülasyon uyumluluk dosyaları hazırlanır. Performans çalışmaları için örneklem büyüklüğü ve istatistik planı, referans materyal standardizasyonu (kopya/reak. kalibrasyonu), UDI etiketleme ve EUDAMED kayıt; PMS-trend analizleri ve PMPF (saha veri toplama) çevrimi gibi adımlar planlanmıştır.
PROJENİN BÖLGESEL KALKINMAYA KATKISI
Kısa vadede bölgesel kalkınmaya katkısı, bilgi ve üretim kapasitesinin hızla yerelleşmesi ile başlar. LAMP tabanlı optik-ısıtma modülü, yapay zekâ destekli yazılım ve tanı kitinin prototiplenmesi ile makine, elektronik, yazılım ve biyoloji disiplinlerini bir araya getirerek Kastamonu Üniversitesi Teknokent bünyesinde bir şirketin kurulmasını ve bu çatı altında küçük ölçekli imalat atölyesinin faaliyete geçmesini sağlar. Üniversite ve mesleki eğitim kurumlarıyla yürütülen staj ve proje dersleri, genç mühendis ve teknisyenlerin uygulamalı becerilerini artırır ve yerel istihdama doğrudan katkı üretir. Orman işletmeleri ve tarımsal danışmanlık birimleriyle yapılacak pilot çalışmalar, kestane kanserinin sahada ve hızlı biçimde saptanmasını mümkün kılar. Erken müdahale ile ağaç kayıpları ve gelir dalgalanmaları azalır. Ayrıca, bölgesel arıcıların kestane balı üretiminde süreklilik sağlanarak kırsal kalkınma desteklenir. Yerel üretim ve tedarik perspektifinden ise; reaktif dolum, liyofilizasyon, ambalaj-etiket, soğuk zincir ve dağıtım süreçlerinin bölgede kurulması; kit komponentlerinin (tüp, kapak, desikant, kutu-içi kalıp) yerel tedariki ile maliyet ve teslim sürelerinin düşürülmesi hedeflenmektedir.
Orta vadede katkı, prototipin sahaya uyarlanması ve tedarik zincirinin bölge içinde olgunlaşmasıyla derinleşir. Kestane kanserine özgü LAMP kitinin formülasyon, paketleme ve lot izlenebilirliği süreçleri, reaktif dolum-ambalaj, sterilizasyon, etiketleme ve soğuk zincir lojistiği gibi alanlarda yeni iş kolları doğurur. Aynı dönemde bakım-servis ağı, eğitimli saha teknisyenleri ve yedek parça depolarıyla yayılır. Şirketlerin kalite yönetim sistemlerine (kalibrasyon, izlenebilirlik, validasyon) adapte olarak ihracata hazırlık kapasitesi kazanır. Genişleyen pilotlardan toplanan verilerle oluşturulan hastalık yoğunluk haritaları ve risk uyarı panelleri, orman işletmeleri, kooperatifler ve arıcılar için somut fayda üretir. Gereksiz ilaçlamanın ve işgücü kaybının önüne geçilir, ürün verimi ve ekonomik istikrar artar. Üniversite-sanayi iş birlikleri girişimcilik ekosistemini besler. Ayrıca, bölgedeki genç girişimcilere yönelik biyoteknoloji odaklı kuluçka programlarının başlatılması öngörülür. Orman teşkilatı ve kooperatifler için “saha LAMP testi” sertifika programları, IFU ve güvenli atık bertaraf eğitimleri, bölgedeki meslek liselerine kademeli müfredat aktarımı gibi alternatifler değerlendirilecektir.
Uzun vadede etkiler, ürünleşme ve sertifikasyonla birlikte ölçekli ve sürdürülebilir bir kalkınma düzeyine taşınır. TRL-7 olgunluktaki sistem ve CE/IVDR uyumlu LAMP kitinin seri üretimi, bölgeyi biyoteknoloji alanında bir üretim üssüne dönüştürebilir ve yüksek katma değerli ihracat potansiyeli açığa çıkar. Bölge, teknoloji üretip ihraç eden, doğayı koruyan ve nitelikli istihdam sağlayan dayanıklı bir ekonomi yapısına kavuşur. Bunun yanı sıra, Kastamonu özelinde biyoteknoloji ve ormancılık temelli ihtisaslaşma ile bölgenin ulusal inovasyon ekosistemindeki stratejik rolü güçlenir. IVDR uyumu sayesinde AB pazarına açılım; bölgesel üretimin döviz girdisi ve yan sanayiye (kalıp-ambalaj, plastik enjeksiyon, kalite laboratuvarı) talep oluşturması ihracat ve sertifikasyon etkisi ile uzun vadede gerçekleşmesi planlanan hedeflerdendir.
Kısa vadede bölgesel kalkınmaya katkısı, bilgi ve üretim kapasitesinin hızla yerelleşmesi ile başlar. LAMP tabanlı optik-ısıtma modülü, yapay zekâ destekli yazılım ve tanı kitinin prototiplenmesi ile makine, elektronik, yazılım ve biyoloji disiplinlerini bir araya getirerek Kastamonu Üniversitesi Teknokent bünyesinde bir şirketin kurulmasını ve bu çatı altında küçük ölçekli imalat atölyesinin faaliyete geçmesini sağlar. Üniversite ve mesleki eğitim kurumlarıyla yürütülen staj ve proje dersleri, genç mühendis ve teknisyenlerin uygulamalı becerilerini artırır ve yerel istihdama doğrudan katkı üretir. Orman işletmeleri ve tarımsal danışmanlık birimleriyle yapılacak pilot çalışmalar, kestane kanserinin sahada ve hızlı biçimde saptanmasını mümkün kılar. Erken müdahale ile ağaç kayıpları ve gelir dalgalanmaları azalır. Ayrıca, bölgesel arıcıların kestane balı üretiminde süreklilik sağlanarak kırsal kalkınma desteklenir. Yerel üretim ve tedarik perspektifinden ise; reaktif dolum, liyofilizasyon, ambalaj-etiket, soğuk zincir ve dağıtım süreçlerinin bölgede kurulması; kit komponentlerinin (tüp, kapak, desikant, kutu-içi kalıp) yerel tedariki ile maliyet ve teslim sürelerinin düşürülmesi hedeflenmektedir.
Orta vadede katkı, prototipin sahaya uyarlanması ve tedarik zincirinin bölge içinde olgunlaşmasıyla derinleşir. Kestane kanserine özgü LAMP kitinin formülasyon, paketleme ve lot izlenebilirliği süreçleri, reaktif dolum-ambalaj, sterilizasyon, etiketleme ve soğuk zincir lojistiği gibi alanlarda yeni iş kolları doğurur. Aynı dönemde bakım-servis ağı, eğitimli saha teknisyenleri ve yedek parça depolarıyla yayılır. Şirketlerin kalite yönetim sistemlerine (kalibrasyon, izlenebilirlik, validasyon) adapte olarak ihracata hazırlık kapasitesi kazanır. Genişleyen pilotlardan toplanan verilerle oluşturulan hastalık yoğunluk haritaları ve risk uyarı panelleri, orman işletmeleri, kooperatifler ve arıcılar için somut fayda üretir. Gereksiz ilaçlamanın ve işgücü kaybının önüne geçilir, ürün verimi ve ekonomik istikrar artar. Üniversite-sanayi iş birlikleri girişimcilik ekosistemini besler. Ayrıca, bölgedeki genç girişimcilere yönelik biyoteknoloji odaklı kuluçka programlarının başlatılması öngörülür. Orman teşkilatı ve kooperatifler için “saha LAMP testi” sertifika programları, IFU ve güvenli atık bertaraf eğitimleri, bölgedeki meslek liselerine kademeli müfredat aktarımı gibi alternatifler değerlendirilecektir.
Uzun vadede etkiler, ürünleşme ve sertifikasyonla birlikte ölçekli ve sürdürülebilir bir kalkınma düzeyine taşınır. TRL-7 olgunluktaki sistem ve CE/IVDR uyumlu LAMP kitinin seri üretimi, bölgeyi biyoteknoloji alanında bir üretim üssüne dönüştürebilir ve yüksek katma değerli ihracat potansiyeli açığa çıkar. Bölge, teknoloji üretip ihraç eden, doğayı koruyan ve nitelikli istihdam sağlayan dayanıklı bir ekonomi yapısına kavuşur. Bunun yanı sıra, Kastamonu özelinde biyoteknoloji ve ormancılık temelli ihtisaslaşma ile bölgenin ulusal inovasyon ekosistemindeki stratejik rolü güçlenir. IVDR uyumu sayesinde AB pazarına açılım; bölgesel üretimin döviz girdisi ve yan sanayiye (kalıp-ambalaj, plastik enjeksiyon, kalite laboratuvarı) talep oluşturması ihracat ve sertifikasyon etkisi ile uzun vadede gerçekleşmesi planlanan hedeflerdendir.